Au début du mois d’octobre 1921, l’excitation était à son comble. Banting, Best et Macleod étaient très confiants. Le succès des travaux réalisés avec des extraits pancréatiques avait jusqu’alors suscité beaucoup de questions nouvelles, incitant Banting et Best à explorer de nombreuses avenues différentes. Macleod tenta cependant de modérer leur enthousiasme et leur conseilla de rester concentrés sur la résolution des problèmes en suspens que posait la confirmation de l’efficacité des extraits pancréatiques dans le contrôle du diabète. L’un des problèmes consistait à surmonter les limites de l’approvisionnement en extraits préparés à partir de tissus de pancréas de chien. Aucun ne voulait avoir à compter sur des chiens pour la poursuite des travaux. 

Une possible solution de rechange apparut grâce à une connaissance de Banting : le Dr John G. FitzGerald, directeur des Connaught Laboratories, des laboratoires spécialisés dans les antitoxines, à l’Université de Toronto. Pendant la Première Guerre mondiale, cette entreprise avait pris de l’expansion et intégré un site agricole là où se trouve aujourd’hui la limite nord de Toronto. C’était à la « ferme » de Connaught qu’était préparé le vaccin contre la variole, et des veaux étaient mis à contribution pour sa production. Le canal pancréatique d’un veau pouvait sans doute être ligaturé pour isoler la sécrétion interne, estimaient les chercheurs. Le 4 octobre, Banting et Best visitaient la ferme pour tenter une ligature du canal pancréatique sur un veau. Celle-ci n’a pas réussi, car le veau est mort sous l’effet de l’anesthésie. Cette expérience, bien que frustrante, a engendré d’autres idées.

Banting et Best se sont alors lancés dans une vaste recherche à la bibliothèque de médecine, consacrant beaucoup de temps à la lecture d’articles de journaux sur le diabète et le pancréas ainsi qu’à la consignation de notes sur des fiches. Contrairement à Best, Banting ne correspondait pas au chercheur médical typique du milieu universitaire. Il avait un penchant pour la pratique, et il était donc animé par le désir de tester l’extrait sur des personnes diabétiques.

La recherche menée à la bibliothèque aida Banting et Best à préparer la première présentation et la première publication de leurs travaux. Le 14 novembre (jour du 30e anniversaire de Banting), ils donnaient une conférence au club de lecture (Journal Club) du département de physiologie et à un public restreint, composé d’étudiants, de professeurs et de membres du personnel. La présentation semblait bien se dérouler et fut rehaussée, au cours de la discussion, par une suggestion importante du Dr N. B. Taylor. Celui-ci pensait qu’une expérience de longévité obtenue avec un extrait donné régulièrement à un chien diabétique sur une période prolongée serait utile. Mais d’où viendrait un tel extrait? Le processus de ligature des conduits était fastidieux et coûteux sur plusieurs plans, notamment à cause de la dépendance aux chiens. Il devait exister un meilleur moyen.

Le 16novembre, vers 2 heures du matin, Banting s’éveilla après un sommeil agité avec une idée, suscitée par le souvenir d’une expérience vécue à la ferme de son père, à Alliston, en Ontario : le bétail qu’il aidait à abattre. Il avait récemment lu que les cellules des îlots pancréatiques étaient plus concentrées chez les nouveau-nés parce que les sucs digestifs comme la trypsine, une enzyme, n’avaient pas encore empoisonné la sécrétion interne. De par son expérience de l’agriculture, Banting savait également que les vaches en gestation étaient plus voraces et prenaient plus de poids, et qu’il fallait considérer cet aspect avant l’abattage. Il a donc eu l’idée de recueillir des tissus du pancréas de veaux fœtaux prélevés sur des vaches tout juste abattues, plutôt que d’essayer de provoquer des avortements chez des chiens. Dès le lendemain, Banting et Best se rendaient dans un abattoir local et revenaient à leur laboratoire avec neuf pancréas de veaux fœtaux pour en préparer un extrait sans délai. Ils ont donc administré l’extrait au chien n°27 et vu sa glycémie passer de 0,30 à 0,20 en 20 minutes. Des injections supplémentaires ont fait baisser le taux à 0,08, et des tests effectués 24 heures plus tard ont montré que l’urine du chien était exempte de sucre. Cette nouvelle approche signifiait que plus aucune ligature des conduits ne serait désormais nécessaire. De plus, on ne manquerait plus jamais d’extraits. Les abattoirs pourraient fournir tous les pancréas fœtaux dont Banting et Best auraient besoin.

Avec un approvisionnement constant en extraits, Banting et Best purent enfin se concentrer sur une expérience de longévité. Le chien n°33, autrement connu sous le nom de « Marjorie », était au cœur de cette expérience. Banting et Best procédèrent au retrait du pancréas de ce chien le 17 novembre. Marjorie reçut sa première injection d’extrait de pancréas de veau fœtal le 6décembre. Entre-temps, Banting et Best avaient veillé à améliorer la pureté de l’extrait en ajoutant une dernière étape de filtration à partir de porcelaine non émaillée (un « filtre de Berkefeld »), qui permettait de capter les bactéries et d’assurer la stérilité. Ce procédé avait cependant pour effet de réduire la puissance. Le 23 novembre, plus confiants et un brin audacieux, Banting et Best osèrent s’injecter, l’un et l’autre, de petites doses de 1,5 c.c. (environ 1/3 de cuillère à thé) d’extrait. Cette pratique n’était pas rare chez les médecins et les chercheurs de l’époque, qui ne voulaient pas tester un nouveau médicament sur un patient à moins d’être prêts à le faire d’abord sur eux-mêmes. Cette auto-expérimentation se poursuit de nos jours, mais des codes de pratique plus rigoureux sont appliqués depuis la fin des années 1940. « Aucune réaction », indiquait la brève note de Banting et de Best. Autrement dit, aucun effet néfaste n’avait été observé. Les chercheurs ont ensuite centré leurs efforts sur la rédaction de leur première publication, « Internal Secretion of the Pancreas » (Sécrétion interne du pancréas), qui devait paraître dans le numéro de février 1922 du Journal of Laboratory and Clinical Medicine

Au moment de soumettre leur article en vue de son examen, Macleod reçut un appel à communications pour une réunion de l’American Physiological Society prévue pour la fin décembre à New Haven, au Connecticut. Il a alors suggéré à Banting de préparer un rapport sur les travaux menés pour saisir cette occasion de le présenter. La nouvelle de la recherche encourageante sur le diabète à Toronto commençait à se répandre parmi les spécialistes du domaine, probablement par l’intermédiaire du Dr Lewellys Barker, un Canadien diplômé de l’Université de Toronto travaillant dans un hôpital américain qui avait visité Toronto et assisté à la conférence du Journal Club. Barker avait mentionné le travail de Banting et de Best au Dr Elliott Joslin, lequel avait ensuite écrit à Macleod pour obtenir de plus amples détails et « toute lueur d’espoir à donner aux patients ». Il y avait, écrivit-il, « tant de cas pathétiques ».

Le 6 décembre, Banting et Best franchissaient une nouvelle étape importante en essayant d’utiliser de l’alcool, au lieu d’une solution saline, dans la préparation de l’extrait de veau fœtal. Ils savaient que l’alcool s’évapore à une température beaucoup plus basse que l’eau et, en outre, peut se dissoudre et éliminer certaines des impuretés contaminantes des solutions d’extraction. Le 7 décembre, l’extrait préparé avec la méthode à l’alcool fonctionna bien avec le chien n°23 et Marjorie. Quant à l’utilisation de l’alcool, Banting et Best conclurent que l’agent actif dans le pancréas fœtal devait y être soluble, car il le serait également dans le tissu pancréatique frais d’une vache adulte. Le 8 décembre, Banting et Best retirèrent le pancréas du chien n°35 et procédèrent à la préparation d’un extrait en utilisant la méthode d’extraction à l’alcool. Le 11 décembre, le chien n°35 reçut une injection d’extrait préparé à partir de son propre pancréas entier. Le taux de glycémie de l’animal passa de 0,38 à 0,18 en quatre heures. Il était évident que l’alcool était efficace pour extraire la sécrétion interne de tout le pancréas. Plus besoin de pancréas fœtaux. La recherche pourrait progresser en utilisant des pancréas entiers frais et facilement disponibles qui proviendraient de bovins.

Ces récentes percées incitèrent Macleod à inviter officiellement le Dr James Bertram Collip à rejoindre l’équipe de recherche sur les extraits pancréatiques afin qu’il puisse mettre à profit ses compétences spécialisées en biochimie pour poursuivre le développement et la purification de l’extrait. Collip, né à Belleville en Ontario, avait étudié la physiologie et la biochimie à l’Université de Toronto, où il obtint son doctorat en 1916. Il était devenu professeur titulaire de physiologie à l’Université de l’Alberta.

En 1921, Collip, marié heureux et jeune père, était de passage à l’Université de Toronto pour un congé sabbatique. Basé dans un laboratoire du bâtiment de pathologie de l’Hôpital général de Toronto, Collip amorça ses travaux sur le pancréas de bœuf entier le 12 décembre. Il avait lui-même travaillé avec des lapins rendus diabétiques à des fins expérimentales, au lieu de chiens, et rapidement découvert que des lapins normaux pouvaient être utilisés pour tester la puissance d’un extrait. Il se servait d’un airedale-terrier diabétique pour mesurer l’efficacité anti-diabétique de son extrait. 

Au même moment, Banting et Best tentaient également de purifier l’extrait de bœuf entier. Ils expérimentèrent la dialyse et l’utilisation du toluène, un hydrocarbure clair qui sent le diluant à peinture, après évaporation alcoolique, afin d’éliminer de l’extrait les impuretés sous forme de matières grasses. Banting et Best préparèrent une grande quantité de leur extrait, mais au moment d’effectuer des tests, ils constatèrent qu’il manquait de puissance, d’après des résultats obtenus sur des chiens diabétiques. Cependant, ils avaient encore un extrait qu’ils savaient puissant et, le 21décembre, ils décidèrent de l’essayer sur un collègue médecin, le Dr Joseph Gilchrist, qui souffrait de diabète. Ils administrèrent l’extrait par une sonde gastrique plutôt que par injection. Pour Banting et Best, cela valait la peine d’essayer en raison de la santé déclinante de Gilchrist. L’extrait n’a toutefois eu aucun effet sur Gilchrist, ni positif ni négatif. 

Les frustrations de Banting et Best ne diminuèrent pas, si bien que les chercheurs décidèrent de faire une pause pour Noël. Mais Collip, de son côté, faisait des progrès importants. Il avait pu utiliser un distillateur sous vide pour faire évaporer l’alcool de la solution d’extrait, bien que partiellement seulement. Une filtration suivait ce procédé. L’extrait ainsi obtenu fut très efficace pour réduire le taux de sucre dans le sang de l’airedale-terrier. Collip avait également testé l’urine du chien et constaté que l’extrait le laissait complètement sans sucre ni cétone. Cette découverte marqua une autre étape importante. En même temps, Collip démontra que l’extrait rétablissait un aspect essentiel de la fonction hépatique du chien diabétique : la fabrication de glycogène à partir des glucides que le chien avait consommés. En temps normal, le pancréas réagit à des niveaux de glucose sanguin plus élevés après un repas en libérant de l’insuline, qui abaisse le taux de glucose sanguin en amenant le foie et les muscles à absorber le glucose du sang et à le stocker sous forme de glycogène. Après Noël, Collip partagea ses résultats impressionnants avec Banting, Best et Macleod lors du voyage en train vers New Haven.

Banting espérait que la rencontre tenue à New Haven le 30 décembre serait un triomphe, mais celle-ci s’est avérée particulièrement décevante, du moins pour lui. Il était si nerveux qu’il ne put faire une présentation convaincante, et Macleod ressentit le besoin d’intervenir pour le sauver. Tout le gratin des spécialistes du diabète était là, dont les docteurs Joslin et Frederick Allen. Des questions difficiles furent posées. Macleod dût faire face à un scepticisme considérable de la part des spécialistes présents dans l’assistance, mais l’un d’entre eux, le Dr George Clowes, directeur de recherche chez Eli Lilly & Co. d’Indianapolis, en Indiana, se montra impressionné par ce qu’il entendit. Il s’était approché par la suite de Macleod, lui proposant la collaboration d’Eli Lilly pour l’aider à développer l’extrait. La proposition fit l’objet de discussions avec Banting et Macleod, mais ceux-ci déclinèrent poliment l’offre, car les travaux n’étaient pas suffisamment avancés pour envisager une préparation commerciale. Néanmoins, ils garderaient la proposition de Clowes à l’esprit. Sa performance hésitante à New Haven et le sauvetage de Macleod ne firent qu’ajouter aux frustrations croissantes de Banting. En outre, elle alimenta ses soupçons quant à l’intention de Macleod de reprendre le travail. Le voyage de retour en train s’annonçait particulièrement difficile pour Banting.

Les incertitudes continuèrent de peser jusqu’en janvier du côté de Banting, qui se sentait isolé, alors que, du côté de Collip, les succès s’accumulaient grâce à son extrait. Et Banting voyait Collip et Macleod travailler plus étroitement. Par ailleurs, Best était également fort occupé à effectuer des tests spécialisés de quotient respiratoire (QR). Ces tests visaient à mesurer le rapport entre le dioxyde de carbone expiré et l’oxygène absorbé. On considérait qu’ils pouvaient donner une indication fiable, permettant de savoir si les glucides étaient brûlés ou non dans le corps. Si ce rapport était supérieur à la normale, le diabète était pointé comme cause, mais un test de QR pouvait montrer la capacité de l’insuline à réduire le ratio CO2/O2. De plus, Best avait recueilli des pancréas de bœuf pour Collip, et avait aussi effectué les premières étapes d’extraction. Banting devait pour sa part effectuer les opérations occasionnelles, mais il était de plus en plus impatient de voir un premier essai officiel de l’extrait. 

Naturellement, Banting pensa qu’il devait l’administrer. Il n’avait cependant pas de statut officiel en tant que médecin à l’Hôpital général de Toronto. Il fit tout de même pression sur Macleod pour que soit effectué un essai sur l’être humain. À son tour, Macleod poussa le Dr Duncan Graham, qui supervisait la clinique du diabète, à demander l’autorisation de l’hôpital. Mais Graham refusa la demande de Banting pour un statut temporaire, faisant remarquer qu’il n’avait aucune expérience dans le traitement de patients diabétiques. En l’absence d’une réponse raisonnable, Banting continua de plaider en faveur d’un essai. Macleod céda finalement lorsque le père d’un garçon de 14 ans donna à l’Hôpital général de Toronto la permission d’administrer l’extrait dans un effort désespéré pour sauver son fils, Leonard Thompson. L’expérience de longévité avec Marjorie s’était bien passée, et il était logique pour Banting et Best, et à contrecœur pour Macleod, d’essayer l’extrait sur Thompson.

Le 10 janvier, Best prépara un extrait de pancréas de bœuf entier en utilisant la méthode mise au point en décembre, qui intégrait l’utilisation d’un distillateur sous vide selon le procédé développé par Collip. Les chercheurs avaient testé sa puissance sur un chien, puis s’étaient fait de petites injections pour s’assurer que l’extrait était sans danger. Le lendemain, ils apportèrent un flacon de l’extrait de l’autre côté de la rue, à la clinique diabétique de l’hôpital. L’après-midi du 11 janvier, un jeune médecin d’établissement, Ed Jeffrey, administra 15 c.c. de l’extrait par une injection sur chacune des fesses de Thompson, de 7,5 c.c. Tout ce que Banting et Best purent faire alors, c’est attendre – dans le couloir à l’extérieur de la salle. Ils n’étaient pas autorisés à manipuler des spécimens, car la conduite des tests était sous la responsabilité de l’hôpital. Le taux de sucre dans le sang de Thompson passa de 0,44 à 0,32, et celui dans ses urines baissa modérément. Les résultats du « sérum de Macleod », comme l’indiqua le graphique de Thompson, furent certes positifs, mais décevants pour Banting, Best et Macleod. Il y avait bien eu une baisse de 25 % de la glycémie ainsi qu’une réduction du sucre dans l’urine, mais l’effet modeste de l’extrait ne l’emportait pas sur la réaction à celui-ci. Un abcès stérile s’était développé à l’un des points d’injection, causé par des impuretés restées dans l’extrait, et non à cause d’un quelconque agent infectieux.

Lorsque Collip eut vent qu’un essai humain de l’extrait de Banting et Best avait été tenté, il fut plutôt énervé. Leur démarche avait compromis les arrangements de l’équipe de recherche et avait transformé la quête de purification de l’extrait en une compétition. Le 14janvier, le Toronto Star publiait un article sur le premier essai humain. Les tensions étant déjà élevées au sein de l’équipe, et la publicité engendrée par l’article ne fit qu’aggraver la situation. Un journaliste, Roy Greenaway, avait entendu parler de l’essai fait sur le jeune Thompson et s’était frayé un chemin jusqu’à Best, puis jusqu’à Macleod. Macleod avait été très prudent lorsqu’il avait discuté de l’extrait avec le journaliste et lui avait fortement recommandé de ne rien publier. Greenaway publia tout de même l’article, qui mentionnait à peine Banting et Best. Cette omission avait encore plus contrarié Banting. Son mentor, le Dr Starr, avait rapidement été en mesure d’organiser une rencontre entre Banting et Macleod pour tenter d’apaiser les craintes de Banting, qui croyait que le réputé physiologiste allait lui voler son travail. Dans un premier temps, Macleod ne prit pas les préoccupations de Banting au sérieux, mais lorsque Duncan Graham lui fit comprendre que Banting ne rigolait pas, il est tout de suite allé voir Starr. Il savait que Banting avait confiance en celui-ci. Quand Banting et Macleod se sont finalement rencontrés, ils ont pu dissiper les malentendus entre eux, du moins de façon temporaire.

Outre la dynamique entre les membres de l’équipe de recherche sur le plan personnel, la pression était désormais forte sur Collip pour qu’il prépare un extrait purifié qui serait puissant, sans toutefois causer de réactions. La compétence de Collip dans l’extraction de l’insuline et de plusieurs autres hormones allait devenir légendaire dans la recherche médicale canadienne. L’opération nécessitait une combinaison de talents, de chef, de brasseur et de magicien. On voyait Collip sautant à la hâte dans son laboratoire, brassant et filtrant, distillant et évaporant, concentrant et diluant, centrifugeant, et mélangeant différents échantillons d’extraits.  Il travaillait rapidement, reflétant son tempérament agité, et faisait rarement le même extrait deux fois, car il oubliait souvent ce qu’il avait fait. Cependant, en janvier 1922, la « chimie de la baignoire » de Collip avait permis de préparer une meilleure version de l’extrait de boeuf entier. Les variables étaient infinies, mais la méthode de Collip consistait à augmenter progressivement la concentration d’alcool dans les mélanges pancréatiques. Le chercheur avait rapidement découvert que le degré de concentration de l’agent actif restait de plus en plus élevé, tandis que la plupart des protéines se séparaient de la solution et que les matières grasses et les sels pouvaient finalement être extraits par centrifugation – en appliquant une force centrifuge à travers une rotation à haute vitesse pour séparer les particules d’une solution – et par lavage. Le 16 janvier, Collip découvrit qu’à une certaine limite de la concentration d’alcool (un peu plus de 90 %), il pouvait obtenir la sécrétion interne sous la forme la plus pure jamais vue jusqu’alors. Après avoir testé sa puissance sur des lapins et attendu de vérifier la présence d’abcès sur la peau du lapin où l’extrait avait été injecté, Collip sut qu’il détenait l’extrait qui allait pouvoir être testé sur les patients de la clinique diabétique de l’Hôpital général de Toronto. 

Le 23 janvier, le traitement de Leonard Thompson fut repris avec l’extrait de Collip. L’adolescent n’avait reçu que le seul traitement à l’insuline de l’extrait de Banting et Best, et il était revenu à un traitement basé sur le régime alimentaire. Cette fois, après l’injection de l’extrait de Collip, l’effet fut assez spectaculaire; le taux de glycémie (sucre dans le sang) chuta et celui de glycosurie (sucre dans l’urine) devint presque nul. Leonard fit des progrès rapides, devenant plus actif et plus fort, et ayant meilleure mine. De plus, il n’y eut pas d’abcès ni d’autres effets secondaires. Cette fois, l’extrait pancréatique avait manifestement fonctionné.

Au moment où Thompson reçut une injection de cette nouvelle version de l’extrait de bœuf, Collip rendait visite à Banting et Best. 

« Bon, les gars, dit-il aux jeunes chercheurs, je l’ai eu. » 

« Comment avez-vous fait? », demandèrent Banting et Best.

Collip répondit : « J’ai décidé de ne pas vous le dire », précisant que Macleod était d’accord. 

Il annonça ensuite qu’il quittait le groupe et menaça de déposer son propre brevet sur l’extrait. En train de bouillir en écoutant ces paroles, Banting finit par perdre son calme et tenta de frapper Collip. Heureusement, Best intervint pour le retenir avant que l’altercation ne tourne à la violence. Cette confrontation résultait d’une combinaison de facteurs – la fatigue, les nerfs à vif, la frustration, l’excitation et une certaine paranoïa chez Banting, Collip, Macleod, et, dans une moindre mesure, Best. Ce conflit a failli compromettre l’avenir de leurs travaux. 

Cependant, vers le 25janvier, la tempête était passée. Peu après l’explosion entre Banting et Collip, le Dr FitzGerald, des Laboratoires Connaught, ainsi que Velyien Henderson, facilitèrent les rencontres avec Collip et Macleod pour régler tout ce gâchis, exacerbé par la méfiance (surtout entre Banting et Collip). FitzGerald, un allié de Banting et de Best, était devenu très préoccupé par le fait que Collip était tout à fait dans son droit de retourner en Alberta et de breveter sa méthode de purification des extraits de bœuf, et ce, en faisant fi de ce qui avait été réalisé à Toronto. Ce serait une catastrophe si Collip partait dans de telles circonstances. Pour éviter un tel dénouement, FitzGerald put officialiser par écrit un accord de recherche et développement fondamental entre Connaught et Banting, Best, Collip et Macleod. 

Daté du 25 janvier 1922 et signé par les quatre hommes, ainsi que par le président du comité Connaught de l’Université de Toronto, Albert E. Gooderham, l’accord était basé sur deux conditions essentielles : premièrement, les collaborateurs devaient accepter de ne pas déposer de brevet auprès d’une société pharmaceutique commerciale pendant une période de collaboration initiale avec Connaught; deuxièmement, aucune mesure qui entraînerait une modification à la politique concernant les travaux de recherche ne serait autorisée à moins d’un négociation préalable entre FitzGerald et les quatre collaborateurs. FitzGerald offra les modestes installations de Connaught et l’expertise du laboratoire en matière de production de produits biologiques, ainsi que 5 000 $ provenant des fonds de réserve du laboratoire, pour aider à accélérer le développement et la production de l’extrait en vue d’essais cliniques élargis. Il avait également été convenu que Connaught [traduction] « examine ultérieurement la question de la production commerciale de l’extrait ou des extraits si et lorsque son (ou leur) mérite aura été établi et que son (ou leur) mode de préparation aura été donné au monde ».

En février 1922, six autres patients diabétiques de l’Hôpital général de Toronto étaient traités avec succès grâce à cet extrait – un exploit réalisé de concert avec le Dr Gilchrist. Banting et Best présentèrent un document sur leur recherche à un groupe de médecins de l’Académie de médecine de Toronto, en plus de contribuer à un article fondateur, « Pancreatic Extracts in the Treatment of Diabetic Mellitus » (Les extraits pancréatiques dans le traitement du diabète sucré), qui fut soumis pour une publication rapide dans le Journal de l’Association médicale canadienne. Entre-temps, Roy Greenaway, du Toronto Star , incitait Macleod à écrire l’histoire complète des travaux. Cette fois, Macleod se sentit beaucoup plus à l’aise en constatant tout l’intérêt que suscitait cette histoire.